骨髓间充质干细胞成骨分化的研究与进展

摘  要：目的本综述全面归纳总结了骨髓间充质干细胞的分离培养、骨髓间充质干细胞鉴定方法、成骨诱导方法、成骨分化鉴定及其在临床中的应用，为证实其作为种子细胞治疗骨组织疾病提供理论依据。方法以骨髓间充质干细胞、成骨分化、成骨细胞、临床应用“Bonemarrow mesenchymal stem cells, osteogenesis differentiation, osteoblasts cell, clinicalapplication”为检索词，应用计算机搜索CNKI数据库、万方数据库、维普数据库、PUBMED数据库，检索年限为2010-2017年，经过纳入排除保留相关文献进行系统综述。纳入标准：文章所述内容与骨髓间充质干细胞生物学特性、成骨分化、发展现状及临床应用有关。排除标准：重复和陈旧的文献。结果与结论骨髓间充质干细胞在体外诱导条件下可以分化为成骨细胞，由于其较易获得并具有良好的增殖能力在临床应用中具有广阔的治疗前景。

关键词：骨髓间充质干细胞(BMSCs)；成骨分化；成骨细胞；临床应用

Researchand development of osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stemcells

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Abstract Objective  This review summarizes the isolation and culture of bone marrowmesenchymal stem cells, osteogenic induction Methods, related identificationand its clinical application, provide a theoretical basis for confirming thetreatment of bone tissue diseases as seed cells.Method  We retrieved the articles in CHKD database,Weipu database,Wanfang database and PUBMED database published for nearly 5years using the key words“bone marrow mesenchymal stem cells, osteoblast cells,osteogenesis differentiation,clinical application.”After inclusion andexclusion reservations systematic review relevant literature.Inclusioncriteria: The contents of the article are related to the biologicalcharacteristics of bone marrow mesenchymal stem cells, osteogenicdifferentiation, development status and clinical application. Exclusioncriteria: duplicate and obsolete literature.Result and conclusion Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)candifferentiate into osteoblasts in osteogenic induction medium,Because of theireasy availability and good proliferative capacity, bone marrow mesenchymal stemcells have broad therapeutic prospects in clinical application.

Keywords  bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs);osteogenicdifferentiation;osteoblasts;clinical application

 目前，自体骨移植、异体骨移植、人工骨替代品移植是骨缺损的主要治疗手段，但是各种方法均有局限性，导致临床效果不佳。自体骨取骨量有限且创伤较大，容易导致术后感染和并发症。异体骨移植虽来源不受限，但是具有潜在的免疫应答风险^[1-2]。因此，快速、安全的骨缺损修复方法成为近年来骨伤病领域的研究方向。骨髓间充质干细胞（英文全称，BMSCs）起源于中胚层细胞，是一种具有多谱系分化、增殖能力强且易于基因转染等特点的多潜能干细胞，在不同条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等^[3-6]。BMSCs取材方便、低免疫原性、易于基因转染^[7]，并且通过特定基因转染BMSCs可以有效抑制同种异体移植后的免疫排斥反应。所以BMSCs是再生医学和组织工程的重要来源细胞。

1BMSCs的分离培养和鉴定

1.1 BMSCs分离培养  BMSCs来源有限，在骨髓中的含量极少，只为0.01%-0.1%^[8]，但BMSCs在体外有较强的增殖能力，传代次数对细胞增殖能力影响较小^[9]。目前，国际上对于BMSCs体外分离培养的方法主要包括全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞术分选法、免疫磁珠法。其中最常用的为全骨髓培养法和密度梯度离心法^[10]。

流式细胞术分选法和免疫磁珠法是利用荧光和磁珠标记BMSCs表面抗原，其优点是操作较简单，分选精确度高，速度快，缺点为在分选过程中可造成细胞破坏和死亡，仪器设备昂贵，所需细胞数量较多，较少采用^[11]。

密度梯度离心法优点是操作简便，缺点是破坏了生长因子和完整的原始BMSCs微环境，不利于BMSCs集落。

全骨髓贴壁培养法对细胞损伤小，细胞增殖迅速，可以获得高纯度、高活性的BMSCs。因此，全骨髓贴壁法是一种简单、有效的体外培养BMSCs的方法^[12-14]。

1.2 BMSCs鉴定  BMSCs可以表达多种表面抗原，但是缺乏特异性表面标志物，目前尚无统一鉴定BMSCs的方法，最常采用的是流式细胞术和免疫荧光染色法，可使用倒置显微镜观察细胞形态变化作为辅助鉴定。

流式细胞术：骨髓中主要有造血干细胞和BMSCs，BMSCs主要表达CD44、CD90等表面标志物，而不表达造血细胞表面标志物CD34、CD45^[15]。流式细胞术通过荧光标记的单克隆抗体而将细胞分选，BMSCs鉴定结果显示CD29、CD90、CD44阳性，CD34、CD45阴性，从而与造血干细胞相鉴别。

免疫荧光染色法：通过用免疫荧光三重技术鉴定BMSCs表面抗原表达，在激光共聚显微镜下观察骨髓间充质细胞表达CD29、CD90，不表达CD45^[16-17]。

2BMSCs体外定向分化为成骨细胞的诱导方法

BMSCs在体外成骨分化很大程度上依赖于成骨诱导培养基（成分地塞米松(Dex) 、β-甘油磷酸钠(β-GP) 和维生素C(Vit C)），其是BMSCs干细胞骨向分化的基本辅剂^[18]。Dex可有效增强骨形态蛋白-2（BMP-2）的成骨能力，诱导BMSCs选择性增殖，刺激核心结合因子a1(RUNX2)，碱性磷酸酶(ALP)，骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)的表达，增加ALP的mRNA表达水平^[19-20]。β-GP作为羟基磷灰石中磷酸盐的来源，提供磷离子，诱导激活ALP，并影响细胞内信号分子。VitC是胶原脯氨酰羟化酶的辅助因子，调控细胞外基质胶原稳态，并增强DNA活性，促进细胞分化^[21]。近年来，据报道有多种不同类别的物质具有促进BMSCs体外成骨分化的作用，可显著提高BMSCs细胞纯度。

2.1 中药提取物  有些中药成分具有促进BMSCs成骨分化和增殖的作用，有利于骨缺损的修复。鲍远等^[22]采用含淫羊藿苷的成骨诱导培养基培养BMSCs作为实验组，不含淫羊藿苷作为对照组。结果显示实验组成骨基因表达和钙结节数量明显高于对照组，证实淫羊藿苷和成骨诱导培养基具有协同促进成骨分化的效应。

张洪跃等^[23]在BMSCs成骨诱导培养基中加入不同浓度梯度的补骨脂素，结果显示补骨脂素能通过调控RUNX2和OCN 蛋白的表达来促进成骨分化，从而有助于维持骨代谢动力平衡。

2.2 生物材料  有些生物材料可促进骨形成蛋白表达，进而增强BMSCs成骨分化能力。易兵成等^[24]通过用不同浓度的丝素蛋白溶液培养BMSCs，结果显示0.05%的丝素蛋白溶液能促进BMSCs的增殖和碱性磷酸酶的表达。

Lin K^[25]等将BMSCs与结合Sr元素的多孔硅酸钙陶瓷材料(SrCS)离子提取物复合培养，体外实验表明SrCS释放的Sr和Si元素可提高BMSCs成骨基因和mRNA表达水平。

2.3 其他  富血小板血浆（PRP）是高度浓缩的血小板，其内含有多种生长因子，可以促进BMSCs的增殖和分化。ZouJ^[26]等分别采用PRP增强培养基和对照培养基体外培养兔BMSCs，结果显示与对照组相比，PRP组BMSCs增长迅速，ALP染色为强阳性，骨钙蛋白(OCN)和OPN的mRNA表达水平高。

此外，激素也可以诱导BMSCs向成骨细胞分化，NiadaS^[27]等采用17β-雌二醇增强培养基处理处理BMSCs作为实验组，标准培养基作为对照组，结果显示ALP活性增强，脂质空泡形成增加。

3成骨分化鉴定  

成骨细胞是骨形成的主要功能单位，在骨组织工程中具有重要作用。目前，鉴定成骨细胞的方法主要有：形态学观察法、碱性磷酸酶染色法、茜素红染色法。

 形态学观察法：通常是用倒置显微镜观察其形状特征，经成骨诱导后，细胞由长梭形变为多边形，细胞核成卵圆形，细胞有聚集成团的生长特性，并可见细胞结节^[28]。

碱性磷酸酶染色法：碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞成熟的标志性酶之一，在细胞外基质矿化中起关键作用，功能活跃的成骨细胞碱性磷酸酶染色为阳性^[29-30]。目前常用的染色方法有钙钴法和偶氮偶联法。采用钙钴法颗粒为灰黑色，采用偶氮偶联法颗粒为红色。

茜素红染色法：茜素红染色是一种对钙质的特异性染色方法。用于染色骨组织中的矿化成分，与钙剂相结合而着色。成骨细胞可在体外矿化，形成矿化结节，经茜红素染色为红色^[31]。

4BMSCs在临床中的应用

BMSCs是骨组织工程中最常用的细胞来源，它可以通过分化直接参与组织修复与再生^[32]。目前，BMSCs已经成功地重建了骨缺损，骨关节炎，骨坏死，骨折重塑等。

4.1 BMSCs治疗骨缺损  目前直接应用骨移植治疗骨缺损的方法受到移植物与宿主骨不完全整合和不完全血管化的限制，因此细胞疗法作为骨缺损修复的替代疗法逐渐成为学者们关注的热点^[33-34]。

BMSCs在一定条件下可分化为成骨细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化，从而实现骨再生。OsugiM等^[35]将含细胞因子的细胞培养基移植到骨缺损部位，结果显示BMSCs迁移至缺损部位的数量较多并促进骨缺损的修复。Doğan A等^[36]构建股骨缺损模型，将BMSCs移植到含硼的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架中，结果显示，含硼PLGA支架可提高OC、Ⅰ型胶原蛋白表达水平。Wei B等^[37]证实聚己内酯（PCL）支架可以促进BMSCs增殖和分化，增强骨形成与骨整合。

4.2 BMSCs治疗骨关节炎  骨关节炎（OA）是关节的常见慢性退行性疾病。BMSCs具有免疫调节特性、抗炎症和再生骨软骨的能力，自体BMSCs移植治疗因其安全性，可行性和良好的临床疗效，可为预防甚至逆转关节退化提供新的思路^[38-39]。

Vega A等^[40]将30例骨关节炎患者进行随机分组，实验组在关节内注射BMSCs，对照组进行关节内透明质酸注射，追踪观察结果显示BMSCs处理组患者功能演算指数(algofunctionalindex)和软骨质量显著改善。骨髓病变可能与OA的进展密切相关，骨髓病变区的BMSCs增殖分化能力低，故用健康的BMSCs替换软骨下病变区的BMSCs是一种治疗OA的有效手段^[41]。

4.3 BMSCs治疗股骨头坏死（ONFH）  股骨头坏死常用的治疗方法为全髋关节置换术，但术后存在较大风险，目前应用BMSCs治疗股骨头坏死显示出良好的应用前景。FuQ^[42]等将体外分离的兔BMSCs移植到建立的兔ONFH模型中，采用RT-PCR技术检测成骨相关基因BMP-2和成脂相关基因PPAR-γ的表达水平，结果显示BMP-2表达上调，PPAR-γ表达下调，兔BMSCs移植有利于ONFH的治疗。

此外，BMSCs与富血小板血清(PRP)联合治疗股骨头坏死具有良好的疗效，RPR可以促进BMSCs的增殖和分化^[43]。目前，低强度脉冲超声(LIPUS)与自体BMSCs移植联合应用治疗股骨头坏死显示出良好的促进新骨形成的作用，具有安全和有效性^[44]。

4.4 BMSCs修复椎间盘和软骨   椎间盘由三部分组成：关节盘软骨、髓核、纤维盘。应用传统手术修复椎间盘不能逆转退化，只能缓解疼痛，组织工程技术成为修复和再生椎间盘的最佳治疗方法。XiaoheLi等^[45]采用在地塞米松磷酸钠溶液基础上添加BMSCs的处理作为实验组来处理纤维环变形的椎间盘，发现实验组椎间盘厚度和胶原水平明显升高,显示出BMSCs修复纤维环的有效性。

在临床治疗领域，修复软骨缺损的关键是再生的软骨与周围软骨的整合。ArakiS等^[46]建立猕猴髌骨沟软骨缺损模型，实验组分为两组，一组在骨缺损处插入BMSCs和胶原凝胶，另一组只单独插入胶原凝胶，对照组未处理。结果显示BMSCs处理组软骨质量较好，并且与周围天然软骨无缝密合。

5总结与展望

MSC具有多能分化活性，在医学上也被成为“多能细胞”，不仅具有成骨分化活性，而且能够修复神经系统，在细胞治疗和基因治疗方面也具有广泛的应用前景^[47]。其成骨活性的研究对骨缺损，成骨减少和障碍类疾病具有重要指导意义，但现阶段仍具有一定的局限性：BMSCs在特定条件下可增殖并分化为成骨细胞，但BMSCs增殖分化能力随年龄增长不断减退，自我更新能力有限，在骨髓中含量很低，自体BMSCs的可用受限，因此BMSCs体外扩增技术与同种异体BMSCs移植后降低免疫排斥反应仍是关注的热点之一^[48]；BMSCs在骨组织工程中的应用近年来已取得较大的进展，但是对于大段骨缺损，BMSCs与生物材料复合物植入体内后如何及时建立血供连接仍需进一步研究，并且成骨是否可以满足临床需要的标准还需要进一步检验，目前缺乏长期随访的病例。科学发展的不断进步，将为BMSCs的发展提供广阔的应用前景。

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